Grazie per aver visitato nature.com.Stai utilizzando una versione del browser con supporto limitato per i CSS.Per ottenere la migliore esperienza, ti consigliamo di utilizzare un browser più aggiornato (o disattivare la modalità di compatibilità in Internet Explorer).Nel frattempo, per garantire un supporto continuo, stiamo visualizzando il sito senza stili e JavaScript.Cursore con tre articoli mostrati per diapositiva.Usa i pulsanti Precedente e Successivo per navigare tra le diapositive o i pulsanti del controller delle diapositive alla fine per navigare attraverso ciascuna diapositiva.Eunmiri Roh, Mee-Hyun Lee, … Zigang DongHellen Paula Valerio, Felipe Gustavo Ravagnani, …Paolo Di MascioIsabel de Pedro, Pilar Alonso-Lecue, … Alberto GandarillasXin Li, Weiwei Mao, … Xiao MiaoYao Yu, Xia Zhang, … Liang ZhangKarl P. Lawrence, Thierry Douki, … Antony R. YoungShunsuke Iriyama, Masahito Yasuda, … Satoshi AmanoZackie Aktary, Alejandro Conde-Perez, … Lionel LarueMaria Zhivagui, Areebah Hoda, … Ludmil B. AlexandrovCommunications Biology volume 6, Articolo numero: 238 (2023 ) Cita questo articoloIl danno al DNA indotto dalle radiazioni solari ultraviolette (UV) è un importante fattore di rischio per lo sviluppo del cancro della pelle.La ridistribuzione della melanina indotta dai raggi UV vicino ai nuclei dei cheratinociti porta alla formazione di un cappuccio sopranucleare, che funge da protezione solare naturale e protegge il DNA assorbendo e diffondendo la radiazione UV.Tuttavia, il meccanismo alla base del movimento intracellulare della melanina nel capping nucleare è poco conosciuto.In questo studio, abbiamo scoperto che OPN3 è un importante fotorecettore nei cheratinociti epidermici umani ed è fondamentale per la formazione del cappuccio sopranucleare mediata da UVA.OPN3 media la formazione del cappuccio sopranucleare attraverso la via di segnalazione del recettore accoppiato a proteine ​​G calcio-dipendente e infine sovraregola l'espressione di Dync1i1 e DCTN1 nei cheratinociti epidermici umani attraverso l'attivazione della trasduzione del segnale calcio/CaMKII, CREB e Akt.Insieme, questi risultati chiariscono il ruolo di OPN3 nella regolazione della formazione del cappuccio di melanina nei cheratinociti epidermici umani, ampliando notevolmente la nostra comprensione dei meccanismi di fototrasduzione coinvolti nella funzione fisiologica nei cheratinociti cutanei.La melanina è il principale determinante della pelle, dei capelli e del colore degli occhi.È importante sottolineare che la melanina svolge un ruolo essenziale nella difesa del corpo dalle dannose radiazioni ultraviolette (UV) e da altre sfide ambientali1.È noto che la melanina viene sintetizzata nei melanosomi dei melanociti e traslocata nei cheratinociti, formando cappucci sui nuclei dei cheratinociti2.I cappucci sopranucleari di melanina risiedono sul lato del nucleo più vicino alla superficie della pelle, fungendo da risposta all'abbronzatura3,4.E i cappucci sopranucleari proteggono i cheratinociti umani dai danni al DNA indotti dai raggi UV5,6.È molto importante esplorare il meccanismo di formazione del cappuccio di melanina.L'accumulo di melanina nella regione perinucleare è un processo complesso.Alcuni studi hanno suggerito che la dineina citoplasmatica e la dinactina siano coinvolte in questo processo3,7.Le catene intermedie della dineina citoplasmatica (Dync1i1) sono la proteina di collegamento che lega l'intero complesso motorio alla subunità p150Glued (DCTN1) del complesso di dinactina e agli organelli associati alla membrana3.Uno studio successivo ha confermato che il knockout di DCTN1 potrebbe inibire l'aggregazione perinucleare dei granuli di melanina e ridurre lo spostamento centripeto medio7.Ciò significa che Dync1i1 e DCTN1 insieme controllano la posizione della melanina perinucleare3,7.Il meccanismo di come i cheratinociti percepiscono la radiazione UV e come l'UV induce e regola la distribuzione della melanina nella parte superiore dei nuclei per ottenere la protezione nucleare non è ancora chiaro.Tutti i sistemi viventi sulla terra usano i fotoni del sole per un vantaggio adattivo.Ad esempio, il rilevamento dei fotoni consente agli animali di identificare gli oggetti attraverso la visione8.Anche le piante e gli animali anticipano il ciclo quotidiano luce-buio utilizzando percorsi non visivi per sincronizzare gli orologi circadiani9.La radiazione UV è costituita da fotoni che possono attivare i recettori accoppiati a proteine ​​G (GPCR) nell'occhio per indurre risposte cellulari attivando diverse proteine ​​G ed effettori a valle10.Negli animali, la maggior parte dei percorsi di risposta alla luce utilizza un membro della famiglia di GPCR opsin (OPN) come rilevatore di luce10,11.Finora sono state identificate più di 1000 OPN nel regno animale12.Queste OPN si sono evolute per soddisfare le particolari esigenze di luce degli organismi che le esprimono13.Negli esseri umani, gli OPN si trovano originariamente negli occhi e svolgono un ruolo nelle funzioni visive e non visive14.Recentemente, i ricercatori hanno scoperto che l'OPN è ampiamente distribuito nei tessuti extraoculari, inclusi cervello, testicoli, fegato e reni15,16, ma le loro funzioni non sono chiare.La mancanza di dati funzionali sull'OPN può essere dovuta alla sua struttura unica e all'ampia espressione dalle regioni cerebrali profonde ai tessuti circostanti.In particolare, sempre più rapporti pubblicati mostrano anche che i sistemi di rilevamento UV possono essere presenti nei tessuti della pelle umana e nelle loro cellule17,18,19,20,21,22.Una di queste opsine, OPN3, è prevalentemente espressa nelle cellule del tessuto cutaneo21,23,24,25,26,27.Sebbene la funzione fisiologica e patologica di OPN3 sia stata svolta in molti aspetti, come l'apoptosi dei melanociti24, la regolazione della pigmentazione della pelle25,26,28 e persino l'adesione al progresso del tumore della pelle29, se OPN3 può partecipare e regolare la formazione dei cappucci di melanina in i cheratinociti sottoposti a irradiazione UV necessitano di ulteriori delucidazioni.Qui, mostriamo che OPN3 è il sensore chiave nei cheratinociti responsabile della formazione del cappuccio sopranucleare indotta tramite UVA.La formazione del cappuccio sopranucleare indotta attraverso OPN3 è dipendente dal calcio e attiva ulteriormente CaMKII, seguita da CREB, portando alla fosforilazione di Akt e infine all'aumento dei livelli di espressione di Dync1i1 e DCTN1.In conclusione, il nostro studio fornisce approfondimenti sui meccanismi molecolari mediante i quali i cheratinociti umani rispondono alle radiazioni UVA per indurre la formazione del cappuccio sopranucleare, il che suggerisce che OPN3 svolge un ruolo fisiologico nella risposta della pelle alle radiazioni UV.Nella pelle, la melanina viene trasferita dai melanociti ai cheratinociti vicini e la melanina si accumula attorno ai nuclei sotto forma di cappucci di melanina per mitigare il danno UV al DNA.I raggi UV possono indurre la formazione di cappucci di melanina nei cheratinociti30.Nonostante ciò, si sa poco sul destino del trasferimento della melanina dai melanociti ai cheratinociti e sulla formazione di una distribuzione della melanina simile a un cappuccio.Al fine di determinare se i raggi UVA possono indurre la formazione del cappuccio di melanina, abbiamo prima utilizzato espianti di pelle come modello in vitro per studiare, osservato che le particelle di melanina aumentavano e tendevano a raccogliersi attorno ai nuclei dei cheratinociti nell'espianto di pelle irradiata (Fig. 1a e Figura complementare s1a).Contemporaneamente, anche le particelle di melanina sui nuclei dei cheratinociti sono state rilevate mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) (Fig. 1b).Questo fenomeno simile a un cappuccio di melanina si trova principalmente nella regione basale dei cheratinociti epidermici.Inoltre, utilizziamo cheratinociti primari umani (HEK) co-coltivati ​​con melanociti (MC) per osservare la formazione di cappucci di melanina nei cheratinociti dopo l'irradiazione UVA (Figura complementare s1b).Inoltre, la melanina prodotta dai melanociti è stata inserita in HaCaT (senza melanina) (Figura complementare s2a) e la presenza di alimentazione di melanina in HaCaT è stata confermata dalla colorazione MF, indicando un'alimentazione riuscita (Figura complementare s2b).Successivamente, abbiamo irradiato il modello di co-coltura di MC e HaCaT irradiato con UVA per osservare la formazione di cappucci di melanina in HaCaT (Figura complementare s2c).una colorazione Masson-Fontana (MF) ha mostrato la localizzazione del cappuccio di melanina negli espianti cutanei dopo 48 ore di irradiazione UVA (gruppo di controllo (sinistra), gruppo di trattamento UVA (destra)).Pan-Cytokeratin (Pan-CK) (rosso) è un marcatore di cheratinociti.I nuclei sono stati controcolorati con 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (blu).Le immagini sono state fissate e analizzate mediante microscopia a campo chiaro/fluorescenza.Barra della scala = 20 µm.b Il cappuccio di melanina è stato osservato mediante microscopia elettronica a trasmissione.Barra della scala = 5 micron.Successivamente, abbiamo ulteriormente esplorato il meccanismo della formazione del cappuccio di melanina indotto dai raggi UVA.La radiazione UV può indurre l'espressione della dineina nei melanociti e mediare il trasporto della melanina31.Precedenti ricercatori hanno confermato che Dync1i1 e DCTN1 svolgono un ruolo importante nella fagocitosi dei melanosomi, nell'aggregazione perinucleare e nella formazione di cappucci di melanina nucleare nei cheratinociti3,7.Per determinare se Dync1i1 e DCTN1 sono coinvolti nella formazione del cappuccio di melanina indotta da UVA dei cheratinociti, nel nostro esperimento, abbiamo prima irradiato HaCaT con diverse dosi di radiazioni UVA, e i risultati hanno mostrato che 3 J/cm2 di UVA sovraregolavano in modo significativo le proteine ​​Dync1i1 e DCTN1 ( Figura supplementare s3a) e livelli di espressione dell'mRNA (Figura complementare s3b, c).Inoltre, gli UVA possono sovraregolare i livelli di espressione di proteine ​​e mRNA di Dync1i1 e DCTN1 in HEK (Figura complementare s3d-f).Negli espianti cutanei, Dync1i1 è stato espresso in strati interi di cheratinociti epidermici e DCTN1 è stato espresso principalmente nei cheratinociti basali.E livelli di espressione più elevati di Dync1i1 e DCTN1 sono stati rilevati nel gruppo di irradiazione UVA rispetto al gruppo di controllo (Figura complementare s3g, h).Per dimostrare se DCTN1 è coinvolto nella formazione del cappuccio di melanina dei cheratinociti indotta da UVA, abbiamo utilizzato quattro gruppi di siRNA mirati a DCTN1 per sottoregolare il livello di mRNA DCTN1 in HEK.L'RNAi-DCTN1 # 1 ha inibito significativamente l'espressione di DCTN1 in HEK (Figura complementare s4a).E anche i livelli di proteina DCTN1 sono ridotti in HEK che esprime siRNA DCTN1 # 1 (Figura complementare s4b).Quindi, abbiamo utilizzato RNAi-DCTN1 # 1 HEK co-coltivato con MC e RNAi-DCTN1 # HaCaT co-coltivato con MC.Data l'irradiazione UVA, abbiamo osservato la capacità di formazione del cappuccio di melanina ridotta nel gruppo sperimentale rispetto a quella nel gruppo di controllo RNAi sia in HEK che in HaCaT (Figura complementare s4c, d).Questi risultati hanno indicato che DCTN1 è necessario per la formazione del cappuccio sopranucleare dei cheratinociti indotta da UVA.Recentemente, alcuni ricercatori hanno proposto un nuovo meccanismo: i raggi UV partecipano alla risposta fisiologica delle cellule della pelle attraverso le opsine come fotosensori19,21,32,33,34.La nostra precedente indagine ha identificato l'espressione di opsine nei melanociti della pelle24, nelle cellule del nevo25 e nelle cellule dei fibroblasti21.Abbiamo inoltre dimostrato che le opsine mediano l'appotosi24, il fotoinvecchiamento21 e la melanogenesi28 nelle cellule della pelle.In questo studio, l'espressione dell'mRNA di OPN (OPN1-sw, OPN2, OPN3, OPN4 e OPN5) è stata rilevata sia in HEK che in HaCaT e l'espressione di OPN3 era la più alta (Fig. 2a, b).È stata rilevata anche l'espressione della proteina OPN3 in HEK e HaCaT (Fig. 2c).Anche la doppia colorazione per immunofluorescenza è apparsa positiva alla colorazione OPN3 sulla membrana e al citoplasmatico di HaCaT e HEK (Fig. 2d, e).L'elevata espressione di OPN3 nei cheratinociti cutanei suggerisce che potrebbe funzionare come fotorecettore epidermico, spingendo ulteriori studi che potrebbero scoprire i loro ruoli fisiologici.Per determinare se i raggi UVA possono indurre l'espressione di OPN3 in HaCaT e HEK, abbiamo utilizzato diverse dosi di radiazioni UVA per irradiare HaCaT.Il risultato ha rivelato che 3 J / cm2 di UVA hanno sovraregolato in modo significativo l'espressione di OPN3 (Fig. 2f) e anche il livello di mRNA è aumentato significativamente (Fig. 2g).Per confermare ulteriormente questi risultati, utilizziamo ulteriormente l'irradiazione UVA di 3 J / cm2 su HEK, anche i livelli di espressione di proteine ​​e mRNA di OPN3 sono aumentati significativamente (Fig. 2h, i).Precedenti studi hanno suggerito che il danno ossidativo causato dall'irradiazione UVA può influenzare la risposta della melanina nelle cellule della pelle35.Tuttavia, in questo esperimento, i cambiamenti di ROS in HEK irradiati con 3 J/cm2 di UVA sono stati misurati mediante microscopio a fluorescenza e citometria a flusso, e questi risultati hanno mostrato che 3 J/cm2 di UVA non potevano produrre ROS (Figura complementare s5a, b).a, b Analisi RT-qPCR dei livelli di espressione genica OPNs in HaCaT e HEK.I livelli di mRNA degli OPN sono stati normalizzati ai livelli di GAPDH (n = 3 esperimenti indipendenti).La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.**** P < 0,0001.c Analisi WB dell'espressione della proteina OPN3 in HaCaT e HEK.d, e Immagini confocali di fluorescenza rappresentative dell'espressione della proteina OPN3 in HaCaT (a sinistra) e HEK (a destra).OPN3 colorato con anticorpo policlonale anti-umano OPN3 (verde), il nucleo colorato con DAPI (blu) e il marker dei cheratinociti Pan-Cytokeratin (Pan-CK) (Cy3, rosso).Barre di scala = 20 µm.Anche la doppia colorazione per immunofluorescenza è apparsa positiva alla colorazione OPN3 sulla membrana e sul citoplasmatico di HaCaT e HEK.f HaCaT sono stati irradiati con UVA (3 J cm-2, 5 J cm-2, 10 J cm-2, 15 J cm-2, 20 J cm-2) e i livelli di espressione della proteina OPN3 sono stati determinati mediante analisi WB.Le analisi WB sono state normalizzate utilizzando la β-tubulina come controllo del caricamento e il livello proteico relativo è stato quantificato utilizzando il software Quantity One.n = 3 esperimenti indipendenti.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.*P<0,05;** P<0,01.g HaCaT sono stati irradiati con 3 J cm-2 UVA e i livelli di mRNA OPN3 sono stati determinati mediante analisi RT-qPCR.I livelli di mRNA di OPN3 sono stati normalizzati ai livelli di GAPDH (n = 3 esperimenti indipendenti).La significatività statistica è stata determinata mediante analisi t-test.** P<0,01.h HEK sono stati irradiati con 3 J cm-2 UVA e i livelli di espressione della proteina OPN3 sono stati determinati mediante analisi WB.Le analisi WB sono state normalizzate utilizzando la β-tubulina come controllo del caricamento e il livello proteico relativo è stato quantificato utilizzando il software Quantity One.n = 3 esperimenti indipendenti.La significatività statistica è stata determinata mediante analisi t-test.* P<0,05;** P<0,01.i HEK sono stati irradiati con 3 J cm-2 UVA e i livelli di mRNA OPN3 sono stati determinati mediante analisi RT-qPCR.I livelli di mRNA di OPN3 sono stati normalizzati ai livelli di GAPDH.n = 3 esperimenti indipendenti.La significatività statistica è stata determinata mediante analisi t-test.** P<0,01.Inoltre, 3 J / cm2 di UVA hanno indotto l'espressione di OPN3 e la formazione del cappuccio di melanina nell'espianto cutaneo (Fig. 3a).Per confermare se OPN3 è coinvolto nella formazione di cappucci di melanina nei cheratinociti come fotorecettore di UVA, abbiamo abbattuto i livelli di mRNA di OPN3 in HEK usando 40 nM e 60 nM RNAi-OPN3.È dimostrato che 60 nM RNAi-OPN3 ha inibito significativamente l'espressione di OPN3 (Figura complementare s6a) e anche i livelli di espressione della proteina OPN3 sono stati ridotti (Figura complementare s6b).Quindi abbiamo utilizzato RNAi-OPN3 HEK coltivato con MC trattato con UVA (3 J / cm2), portando alla formazione di un cappuccio di melanina ridotto nel modello di co-coltura HEK-MC (Figura complementare s6c).Inoltre, abbiamo ulteriormente utilizzato LV-OPN3-RNAi per abbattere l'espressione OPN3 di HaCaT mediante la tecnologia di trasfezione del lentivirus (Figura complementare s7a-c).Abbiamo anche osservato che la formazione di cappucci di melanina era ridotta nel modello di co-coltura HaCaT-MC (Figura complementare s7d).Inoltre, abbiamo inibito l'espressione di OPN3 in HEK mediante la tecnologia siRNA e non abbiamo rilevato cambiamenti significativi nei livelli di espressione di mRNA e proteine ​​di Dync1i1 e DCTN1.Abbiamo provato a utilizzare HEK irradiato con UVA e abbiamo scoperto che l'espressione di mRNA e proteine ​​​​di Dync1i1 e DCTN1 è aumentata.Ma, quando OPN3 era silenzioso, l'espressione di Dync1i1 e DCTN1 indotta da UVA era bloccata (Fig. 3b-e).Abbiamo anche rilevato il cambiamento del livello di espressione di Dync1i1 e DCTN1 indotto da UVA dopo il knockdown di OPN3 tramite la tecnologia di trasfezione del lentivirus in HaCaT.Abbiamo scoperto che i livelli di espressione di mRNA e proteine ​​di Dync1i1 e DCTN1 non sono aumentati (Fig. 4a-d).Inoltre, abbiamo ulteriormente sovraregolato l'espressione OPN3 di HaCaT mediante la tecnologia di trasfezione del lentivirus (Fig. s7e, f supplementare) e l'espressione di Dync1i1 e DCTN1 è aumentata se trattata con UVA (Fig. 4e-h).Questi risultati indicano che OPN3 agisce come un fotorecettore chiave per la formazione del cappuccio di melanina mediata dall'espressione di Dync1i1 e DCTN1 indotta da UVA nei cheratinociti.un'espressione OPN3 (verde) colocalizzata con marcatore HEK Pan-CK (rosso) in espianto cutaneo con colorazione immunofluorescenza, senza UVA (in alto) o con irradiazione UVA (in basso).I nuclei sono stati controcolorati con DAPI.La colorazione di Masson-Fontana (MF) ha dimostrato la formazione del cappuccio di melanina.Le immagini sono state analizzate mediante microscopia a campo chiaro/fluorescenza.Barra della scala = 20 µm.b Dopo che siRNA ha inibito OPN3 irradiato senza o con UVA, WB è stato utilizzato per analizzare i cambiamenti nei livelli di espressione di OPN3, Dync1i1 e DCTN1 in HEK.Le analisi WB sono state normalizzate utilizzando la β-tubulina come controllo del caricamento e il livello proteico relativo è stato quantificato utilizzando il software Quantity One.n = 3 esperimenti indipendenti.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.** P < 0,01, **** P < 0,0001.c Dopo che siRNA ha inibito OPN3 irradiato senza o con UVA, RT-qPCR è stato utilizzato per analizzare i cambiamenti nei livelli di mRNA OPN3 in HEK (n = 3 esperimenti indipendenti).I dati sono stati presentati come media ± SEM.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.** P <0,01, *** P <0,001.d Dopo che siRNA ha inibito OPN3 irradiato senza o con UVA, RT-qPCR è stato utilizzato per analizzare i cambiamenti nei livelli di espressione dell'mRNA DCTN1 in HEK (n = 3 esperimenti indipendenti).La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.***P<0,001.e Dopo che siRNA ha inibito OPN3 irradiato senza o con UVA, RT-qPCR è stato utilizzato per analizzare i cambiamenti nei livelli di espressione dell'mRNA Dync1i1 in HEK (n = 3 esperimenti indipendenti).La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.** P<0,01.un HaCaT è stato trasfettato con lentivirus shOPN3 (shOPN3#1) e controllo lentivirus (shNC), e dopo essere stato irradiato senza o con UVA, WB è stato utilizzato per analizzare i cambiamenti dei livelli di espressione della proteina OPN3, Dync1i1 e DCTN1 in HaCaT (n = 3 indipendenti esperimenti).Le analisi WB sono state normalizzate utilizzando la β-tubulina come controllo del caricamento e il livello proteico relativo è stato quantificato utilizzando il software Quantity One.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001, ****P <0,0001.b – d Dopo che shOPN3 ha inibito OPN3 irradiato senza o con UVA, RT-qPCR è stato utilizzato per analizzare i cambiamenti dell'espressione di mRNA di OPN3, Dync1i1 e DCTN1 in HaCaT (n = 3 esperimenti indipendenti).La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001.e HaCaT è stato trasfettato con la sovraespressione del lentivirus OPN3 (LV-OPN3) e il lentivirus di controllo (controllo LV) e irradiato senza o con UVA.Quindi, WB è stato utilizzato per analizzare i cambiamenti nell'espressione OPN3, Dync1i1 e DCTN1 in HaCaT.La β-tubulina è stata utilizzata come controllo del carico.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001, ****P <0,0001.f – h Dopo la sovraespressione di LV-OPN3 di OPN3 irradiata senza o con UVA, RT-qPCR è stata utilizzata per analizzare i cambiamenti nei livelli di espressione di OPN3, Dync1i1 e DCTN1 in HaCaT.I livelli di mRNA di OPN3, Dync1i1 e DCTN1 sono stati normalizzati ai livelli di GAPDH (n = 3 esperimenti indipendenti).La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001, ****P <0,0001.Il nostro studio e la ricerca di altri team hanno dimostrato che la luce ultravioletta o blu può guidare la mobilizzazione del calcio immagazzinato nei melanociti e nei fibroblasti attraverso OPN321,26.Ulteriori studi hanno scoperto che gli UVA hanno portato al calcio intracellulare tramite i canali del potenziale del recettore transitorio ankyrin 1 e hanno promosso la fosforilazione di CaMKII in HaCaT36.Tuttavia, non è noto se la via di segnalazione del calcio sia coinvolta nella formazione del cappuccio di melanina.In primo luogo, abbiamo misurato i livelli intracellulari di Ca2+ nei cheratinociti prima e dopo l'esposizione ai raggi UVA utilizzando l'indicatore fluorometrico di Ca2+ Fluo-3 AM.I nostri risultati hanno mostrato che i raggi UVA aumentavano il livello intracellulare di Ca2 + (Fig. 5a, b, Fig. s8a, b supplementare) e sovraregolavano la fosforilazione di CaMKII e CREB (Fig. 5c, d).Quando l'espressione di OPN3 era silenziosa, l'afflusso di Ca2 + indotto dai raggi UVA diminuiva attraverso l'immunofluorescenza e la tecnologia di rilevamento della citometria a flusso in HEK (Fig. 5e, Figura s8c supplementare) e abbiamo scoperto che dopo l'esposizione ai raggi UVA, l'espressione di sovraregolazione delle suddette proteine ​​​​correlate al calcio è stato trattenuto dopo una ridotta espressione di OPN3 (Fig. 5f).Per verificare se l'espressione di Dync1i1 e DCTN1 è mediata dalla segnalazione del calcio tramite OPN3, abbiamo utilizzato HEK esposto ai raggi UVA trattato con PTX, un inibitore della segnalazione Gαi.Questa reazione Ca2 + intracellulare indotta da UVA è stata bloccata da PTX (Fig. 6a, Fig. s8d supplementare) e l'esposizione ai raggi UVA ha portato ad un aumento dei livelli di p-CaMKII e p-CREB.Questo effetto è stato ridotto quando Gαi è stato inibito (Fig. 6b).Poiché le proteine ​​​​G possono causare il rilascio di Ca2 + tramite l'attivazione della fosfolipasi Cβ PLCβ (PLA), abbiamo testato se l'espressione di PLC indotta da UVA.L'UVA sovraregola l'espressione del PLC (Fig. 6c) e questo effetto è stato ridotto quando Gαi è stato inibito (Fig. 6d).Inoltre, l'espressione PLC indotta da UVA è diminuita quando OPN3 è stato inibito (Fig. 6e).Questi risultati indicano che gli UVA regolano l'espressione di Gαi/calcio attraverso OPN3.Abbiamo testato l'effetto dell'antagonista PLC U73122 sulle risposte Ca2+ indotte dai raggi UV.Il trattamento di HEK con U73122 ha inibito significativamente i transitori di Ca2 + indotti da UVA (Fig.6f, Fig. s8e supplementare).Allo stesso tempo, sebbene l'esposizione ai raggi UVA aumentasse i livelli di espressione di p-CAMKII, p-CREB, Dync1i1 e DCTN1, questo effetto veniva bloccato quando veniva inibito il rilascio di Ca2+ (Fig. 6g).Questi risultati indicano che gli UVA regolano l'espressione di PLCβ/calcio attraverso OPN3.a, b I flussi di calcio HEK e HaCaT sono stati quantificati mediante citometria a flusso.n = 3 esperimenti indipendenti.La significatività statistica è stata determinata mediante analisi t-test.** P <0,01, *** P <0,001.c, d La proteina chinasi fosforilata Ca2 + / calmodulina-dipendente (CaMK) II e la proteina legante l'elemento di risposta all'adenosina monofosfato ciclico (CREB) sono state analizzate da WB 1 h dopo l'irradiazione di HEK e HaCaT con 3 J cm-2 UVA.Le analisi WB sono state normalizzate utilizzando la β-tubulina come controllo del caricamento e il livello proteico relativo è stato quantificato utilizzando il software Quantity One.La significatività statistica è stata determinata mediante analisi t-test.*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001.e Dopo che siRNA ha inibito OPN3 irradiato senza o con UVA, i flussi di calcio sono stati quantificati mediante citometria a flusso.n = 3 esperimenti indipendenti.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.* P <0,05, ** P <0,01.f Dopo che siRNA ha inibito OPN3 irradiato senza o con UVA, WB è stato utilizzato per analizzare i cambiamenti dei livelli di espressione proteica OPN3, p-CaMKII e p-CREB in HEK (n = 3 esperimenti indipendenti).Le analisi WB sono state normalizzate utilizzando la β-tubulina come controllo del caricamento e il livello proteico relativo è stato quantificato utilizzando il software Quantity One.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.*** P < 0,001, **** P < 0,0001.un HEK trattato con PTX è stato stimolato con 3 J cm-2 UVA e il flusso di calcio è stato quantificato mediante citometria a flusso.n = 3 esperimenti indipendenti.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.** P <0,01, *** P <0,001.b HEK trattate con PTX sono state stimolate con 3 J cm-2 UVA e il livello di espressione proteica p-CaMKII e p-CREB è stato analizzato da WB.Le analisi WB sono state normalizzate utilizzando la β-tubulina come controllo del caricamento e il livello proteico relativo è stato quantificato utilizzando il software Quantity One.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.** P <0,01, *** P <0,001.c HEK sono stati irradiati senza e con UVA e i livelli di proteina PLC-β sono stati determinati da WB.d HEK trattati con PTX sono stati stimolati con 3 J cm-2 UVA;il livello proteico è stato analizzato da WB.e HEK sono stati trasfettati con siRNA contro OPN3 irradiati con UVA e lisati dopo 1 ora.I lisati sono stati analizzati mediante WB utilizzando gli anticorpi indicati (anti-OPN3 e anti-PLC-β).La β-tubulina è stata utilizzata come controllo del carico.f HEK trattato con U73122 è stato stimolato con 3 J cm-2 UVA;flusso di calcio è stato quantificato mediante citometria a flusso.n = 3 esperimenti indipendenti.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.*** P < 0,001, **** P < 0,0001.g HEK trattati con U73122 sono stati stimolati con 3 J cm-2 UVA;Il livello di espressione proteica p-CaMKII, p-CREB, DCTN1 e Dync1i1 è stato analizzato da WB.Le analisi WB sono state normalizzate utilizzando la β-tubulina come controllo del caricamento e il livello proteico relativo è stato quantificato utilizzando il software Quantity One.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001.La via Akt controllava la formazione dei microtubuli, probabilmente regolando il legame con le proteine ​​accessorie, compreso quello della subunità dinattinica DCTN137.La mobilizzazione intracellulare del calcio può attivare la via di segnalazione Akt38.Non è chiaro se Akt svolga un ruolo nella regolazione del DCTN1 nei cheratinociti umani.La fosforilazione di Akt indotta da UVA (Fig. 7a) e questo effetto è stato inibito quando l'espressione di OPN3 è stata messa a tacere (Fig. 7b).Inoltre, la fosforilazione di Akt indotta da UVA è stata eliminata quando il rilascio di Ca2 + è stato bloccato (Fig. 7c).Questi risultati suggeriscono che gli UVA regolano l'espressione di Akt attraverso la via di segnalazione OPN3/calcio.Abbiamo ulteriormente studiato se Akt è coinvolto nella regolazione dell'espressione DCTN1 dopo l'irradiazione UVA.I livelli di espressione Dync1i1 e DCTN1 regolati da UVA sono stati eliminati quando la fosforilazione di Akt è stata inibita da MK-2206 (2HCl) (Fig. 7d).Questi risultati suggeriscono che Akt è coinvolto nella regolazione dell'espressione di Dync1i1 e DCTN1.a Le cellule sono state irradiate senza e con UVA e i livelli di proteina AKT e proteina AKT fosforilata (p-AKT) sono stati determinati mediante WB.La β-tubulina è stata utilizzata come controllo del carico.Il livello proteico relativo è stato quantificato utilizzando il software Quantity One.La significatività statistica è stata determinata mediante analisi t-test.** P<0,01.b HEK è stato trasfettato con siRNA contro OPN3 irradiato con UVA e lisato dopo 1 ora.I lisati sono stati analizzati da WB utilizzando gli anticorpi indicati (anti-OPN3, anti-AKT, anti-p-AKT, anti-Dync1i1 e anti-DCTN1).La β-tubulina è stata utilizzata come controllo del carico.Il livello proteico relativo è stato quantificato utilizzando il software Quantity One.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.***P<0,001.c Le HEK trattate con U73122 sono state stimolate con 3 J/cm2 di UVA e il lisato proteico è stato analizzato mediante WB.La β-tubulina è stata utilizzata come controllo del carico.Il livello proteico relativo è stato quantificato utilizzando il software Quantity One.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.***P<0,001.d HEK trattati con MK-2206 (2HCl) sono stati stimolati con 3 J cm-2 UVA e il lisato proteico è stato analizzato da WB.La β-tubulina è stata utilizzata come controllo del carico.Il livello proteico relativo è stato quantificato utilizzando il software Quantity One.La significatività statistica è stata determinata da un-ANOVA con post-test.** P <0,01, *** P <0,001.In sintesi, i nostri risultati indicano che l'UVA induce l'espressione di Dync1i1 e DCTN1 per promuovere la formazione del cappuccio di melanina nei cheratinociti tramite la via di segnalazione OPN3/calcio/Akt (Fig. 8).OPN3 sovraregola l'espressione di Dync1i1 e DCTN1 nei cheratinociti dopo l'esposizione alle radiazioni UVA attraverso la via di segnalazione Akt e accoppiata a proteine ​​G calcio-dipendente.(Questa figura è stata creata sulla base degli elementi del software Science Slides (http://scienceslides.com/).In questo studio, OPN3, come fotorecettore UVA, svolge un ruolo importante nella formazione dei cappucci di melanina nei cheratinociti epidermici umani.Precedenti giornalisti hanno dimostrato che il cappuccio di melanina depositato nei cheratinociti dell'epidermide umana agisce come un "microparasol" per proteggere il nucleo dai danni al DNA indotti dai raggi UV3,7,39.La qualità e la quantità in vari gruppi razziali, dai caucasici ai neri con fototipi cutanei, presentano nell'epidermide umana un diverso contenuto di melanina e formazione del cappuccio melaninico40,41.Ad esempio, la pelle fortemente pigmentata, come le persone di colore, ospitava più cappucci di melanina rispetto alla pelle leggermente pigmentata, associata all'incidenza del cancro della pelle42,43.Infatti, sebbene la formazione del cappuccio di melanina sia influenzata da molti fattori, è principalmente correlata al colore della pelle o alla pigmentazione della melanina e può essere indotta dall'irradiazione UV in vivo30.Tuttavia, il modo in cui i raggi UV o la luce solare inducono la risposta alla melanina e la distribuzione delle particelle di melanina nei cheratinociti epidermici umani non è completamente compreso.Precedenti studi hanno utilizzato modelli di espianti di pelle umana per studiare la formazione dei cappucci di melanina3,6,7,30.Abbiamo applicato questo modello e confermato la formazione di tappi di melanina nell'irradiazione UVA.Abbiamo anche provato a utilizzare l'innovativo modello di co-coltura di melanociti e cheratinociti e abbiamo studiato ulteriormente il meccanismo di formazione del cappuccio di melanina mediante irradiazione UVA.In questo studio, i nostri risultati hanno mostrato che i raggi UVA possono indurre le particelle di melanina ad aumentare e raccogliersi attorno ai nuclei dei cheratinociti negli espianti cutanei e nei cheratinociti o HaCaT co-coltivati ​​con i melanociti.Byers et al.dimostrato che la dineina citoplasmatica partecipa al trasporto del melanosoma nei melanociti umani31.La dineina citoplasmatica è un motore meccanochimico ATPasi che si muove lungo i microtubuli verso la regione centriolare3.Le catene di dineina citoplasmatiche intermedie leggere associate e le catene intermedie si sono dimostrate coinvolte nel legame con il complesso di dinactina che si attacca agli organelli legati alla membrana44.Studi successivi hanno confermato che Dync1i1 è il motore che partecipa all'aggregazione diretta perinucleare dei melanosomi fagocitati nei cheratinociti umani3.La dineina può essere attivata quando è combinata con una proteina di attivazione dinamica.Ulteriori studi di Byers et al.ha confermato che DCTN1 svolge un ruolo chiave nella formazione dei cappucci sopranucleari dei cheratinociti indotti dai raggi UV7.I nostri dati suggeriscono che gli UVA possono provocare l'espressione di Dync1i1 e DCTN1.Inoltre, quando DCTN1 viene messo a tacere, la formazione del cappuccio di melanina indotta da UVA viene inibita.Ciò indica che DCTN1 svolge un ruolo significativo nella formazione del cappuccio della melanina dei cheratinociti indotta da UVA.Quindi, in che modo i cheratinociti umani rilevano e rispondono alle radiazioni UV e quindi avviano percorsi di segnalazione a valle che regolano la formazione del cappuccio di melanina mediata dalla dineina?La radiazione UV consiste di fotoni.La maggior parte dei rilevatori di luce nei mammiferi sono OPN, una classe di recettori accoppiati a proteine ​​G che convertono l'energia di un fotone in una risposta di segnalazione cellulare45.Ad oggi sono state identificate più di mille opsine negli animali13.Le OPN umane possono essere tradizionalmente classificate come opsine visive (OPN1 e OPN2), opsine non visive (OPN3, OPN4 e OPN5) e fotoisomerasi46,47.Recentemente, l'OPN, come molecola fotoconduttiva chiave trovata nella retina, è emerso come un elemento fotosensibile precedentemente sconosciuto nella pelle23,24,25.Altri studi e il nostro lavoro di ricerca hanno mostrato che le opsine (OPN1-5) sono presenti nella pelle umana21,23,24.In questo studio, OPN3 era altamente espresso nei cheratinociti della pelle umana e HaCaT.Rapporti precedenti hanno mostrato che OPN3 può mediare la sintesi di melanina dei melanociti26,28.Tuttavia, non è stato ancora riportato se la distribuzione dei pigmenti nei cheratinociti sia regolata anche tramite OPN3.In questo esperimento, 3 J/cm2 di UVA possono sovraregolare l'espressione di OPN3 nei cheratinociti della pelle umana.Abbiamo inoltre scoperto che i granuli di melanina si sono raccolti intorno o sopra il nucleo dopo 3 J/cm2 di irradiazione UVA.Quando OPN3 viene messo a tacere, l'effetto di ridistribuzione della melanina che induce UVA viene inibito, il che indica che OPN3 è un fotorecettore chiave per la formazione del cappuccio di melanina indotta da UVA.Successivamente abbiamo cercato di determinare in che modo OPN3 media la via di segnalazione della formazione del cappuccio di melanina.Studi precedenti hanno dimostrato che i pigmenti fotosensibili attivano la proteina G (compresi Gi-, Gt-, Go-, Gq- e Gs-)15.Mosquito OPN3 ha attivato le subunità Gαi/o delle proteine ​​G in modo dipendente dalla luce15 e le subunità Gβγ, che si dissociano da Gαi, hanno attivato PLC-β per indurre la risposta Ca2+48.Sci.Sci.Nat.Comune.Cellula.Proc.Nazionale Acad.Sci.Avv.Cellula.Ris.Proc.Nazionale Acad.Sci.Ris.Sci.Nat.Sci.Proc.Nazionale Acad.Sci.Proc.Nazionale Acad.Sci.Ris.Esp.