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Abd El-BakiTomasz Laskowski, Michał Kosno, … Zofia MazerskaSana Iram, Manaal Zahera, … Mohd Sajid KhanRajkumar Veligeti, Rajesh Bagepalli Madhu, … Grigory Vasilievich ZyryanovMarzieh Golshan, Behnam Gheitarani, … Mahdi Salami HosseiniMostafa A. El-Naggar, Mona Mohammed Sharaf, … Ahmed MA BadrScientific Reports volume 13, Articolo numero: 3383 (2023 ) Cita questo articoloIl nostro gruppo di lavoro ha progettato e sintetizzato un composto cambiario N-(2-idrossifenil)-2-propilpentanamide (HO-AAVPA).L'HO-AAVPA è un inibitore HDAC1 e antiproliferativo nelle linee cellulari tumorali.Tuttavia, HO-AAVPA è scarsa solubilità in acqua e metabolizzato enzimaticamente.In questo lavoro, il dendrimero di poli(ammidoammina) di quarta generazione (PAMAM-G4) è stato utilizzato come trasportatore di farmaci di HO-AAVPA.Inoltre, i complessi HO-AAVPA e HO-AAVPA-PAMAM sono stati sottoposti a studi di degradazione forzata (calore, acido, base, ossidazione e luce solare).Inoltre, il complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 è stato analizzato come antiproliferativo in una linea cellulare di carcinoma mammario (MCF-7).Il complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 è stato ottenuto mediante docking e utilizzando sperimentalmente tre condizioni di pH: acido (pH = 3,0), neutro (pH = 7,0) e basico (pH = 9,0) dimostrando che PAMAM-G4 cattura e protegge l'HO- AAVPA dal degrado forzato, è dovuto alla luce solare che ha prodotto un sottoprodotto di HO-AAVPA.Inoltre, il PAMAM-G4 ha favorito la solubilità in acqua di HO-AAVPA in condizioni di pH basico e neutro con una differenza significativa (F(2,18) = 259,9, p <0,001) tra le pendenze delle tre condizioni essendo la condizione di base che solubilizza la maggior quantità di HO-AAVPA.Infine, il complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 ha mostrato migliori effetti antiproliferativi su MCF-7 (IC50 = 75,3 μM) rispetto a HO-AAVPA (IC50 = 192 μM).Questi risultati evidenziano che il complesso PAMAM-G4 migliora gli effetti biologici di HO-AAVPA.I cambiamenti epigenetici possono modulare l'espressione genica.Questi cambiamenti epigenetici includono l'acetilazione delle proteine e la metilazione dell'acido desossiribonucleico (DNA), tra gli altri, senza mutazioni genetiche o traslocazioni1.Il DNA nel nucleo cellulare è avvolto attorno a proteine chiamate istoni per formare il nucleosoma2.L'acetilazione dei residui di Lys dagli istoni consente al DNA di interagire con il fattore di trascrizione, modulando l'espressione proteica, che è correlata a diverse malattie3.Le istone acetiltransferasi (HAT) acetilano i residui di Lys delle proteine istoniche o non istoniche4, mentre le istone deacetilasi (HDAC) rimuovono il gruppo acetile3.Quindi, gli inibitori dell'HDAC (HDACi) influenzano le funzioni biologiche di diverse cellule del sistema immunitario e del cancro5.La maggior parte degli HDACi è coordinata con uno ione zinco (Zn2+) nel sito attivo dell'HDAC (Zn2+-dipendente), causando l'arresto del ciclo cellulare e la differenziazione e l'apoptosi delle cellule tumorali6.L'acido valproico (VPA) è un HDACi e antiproliferativo nelle cellule tumorali7,8, tuttavia presenta alcuni svantaggi farmacologici dovuti ai suoi effetti cancerogeni9, teratogeni10 e altri effetti collaterali11.Ad esempio, il CYP2C9 metabolizza il VPA attraverso una reazione di deidrogenazione a livello della catena alifatica, producendo un metabolita reattivo, l'acido 2-n-propil-4-pentenoico (4nVPA)12.Nel nostro gruppo di lavoro, è stato progettato un set di derivati aril VPA contenenti SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid) e scaffold VPA con l'obiettivo di migliorare gli effetti inibitori dell'HDAC e le proprietà antiproliferative del VPA13.Da questo lavoro abbiamo ottenuto un composto N-(2-idrossifenil)-2-propilpentanammide denominato HO-AAVPA (Fig. 1) (brevetto messicano: MX 363.005 B).HO-AAVPA ha mostrato effetti antiproliferativi sulle linee cellulari tumorali (HeLa, rabdomiosarcoma, MCF-7, MDA-MB-231 e SKBr3)13.Alcuni studi di tossicità in un modello di ratto mostrano che HO-AAVPA non provoca danno epatico nel trattamento acuto e subcronico, non influisce sull'organogenesi e la sua dose letale 50 (LD50)14 rientra nei limiti di tossicità del farmaco raccomandati15.Tuttavia, durante lo sviluppo e la convalida del metodo analitico di HO-AAVPA sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa (RP-HPLC), è stato identificato un metabolita da uno studio sul metabolismo nei microsomi del fegato di ratto16 che producono due metaboliti17.Inoltre, HO-AAVPA ha una rapida clearance negli studi di farmacocinetica in un modello di ratto18.Inoltre, non sono stati condotti studi sulla stabilità chimica (degradazione forzata) di HO-AAVPA, necessari per tutti i nuovi farmaci, per prevedere i sottoprodotti19.La struttura chimica di HO-AAVPA (gruppi ammidici e fenolici) può subire gli effetti dei radicali liberi, producendo metaboliti che potrebbero indurre effetti collaterali come è stato riportato per altri composti simili20.Le macromolecole sono emerse come promettenti trasportatori di farmaci per la somministrazione di farmaci antitumorali a causa del loro maggiore effetto di migliorare la permeabilità e la ritenzione molecolare21,22.I trasportatori di farmaci a base di lipidi e polimeri sono in grado di sequestrare i farmaci, proteggerli e veicolarli in alcuni tessuti in base a pH, temperatura, flusso sanguigno elevato, utili per i farmaci chemioterapici nel cancro23.I dendrimeri di poliammidoammina (PAMAM) sono stati studiati come trasportatori di farmaci per le loro proprietà fisico-chimiche in grado di formare complessi farmaco-dendrimero24.I complessi farmaco-PAMAM migliorano le proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche dei farmaci perché PAMAM protegge i farmaci (favorisce la stabilità chimica) dagli ambienti fisiologici, aumenta la solubilità in acqua e la biodisponibilità25.Il dendrimero PAMAM ha ammine protonate positive che potrebbero favorire la somministrazione di farmaci in ambienti biologici negativi come il cancro25.Struttura di N-(2-idrossifenil)-2-propilpentanammide (HO-AAVPA).In questo lavoro, sono stati eseguiti docking molecolare e saggi sperimentali per formare un complesso HO-AAVPA-PAMAM.Quindi, il complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 e HO-AAVPA sono stati sottoposti a studi di degradazione forzata.Successivamente, è stata eseguita la caratterizzazione chimica del complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 per essere valutato come antiproliferativo su una linea cellulare di carcinoma mammario (MCF-7).L'HO-AAVPA è stato sintetizzato nel nostro laboratorio13.Il PAMAM-G4 è stato acquistato da Sigma-Aldrich, Messico (412.449-10G).Gli studi sullo stress di degradazione forzata di HO-AAVPA e la sintesi del complesso HO-AAVPA-PAMAM sono stati monitorati mediante cromatografia liquida utilizzando un sistema HPLC della serie 1260 Infinity (Agilent Technologies) dotato di una pompa quaternaria (G1311B), autocampionatore (G1316A), forno a colonna (G1316A), rivelatore a serie di diodi (G1315C) e software OpenLab CDS EZChrom versione A.04.08 per analizzare i risultati.La caratterizzazione della spettroscopia infrarossa (IR) è stata effettuata con un modello Perkin Elmer Spectrum 2000. La caratterizzazione NMR 1H e 13C è stata eseguita con un Bruker ASCEND™ 750 MHz.La caratterizzazione della spettrometria di massa (MS) è stata effettuata con un sistema UHPLC serie 1290 Infinity II accoppiato tramite una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) con tecnologia Jet Strem a un sistema 6545Q-TOF/MS (Agilent Technologies) e al software MassHunter LC/MS La versione di acquisizione dati B.06.01 è stata utilizzata per l'acquisizione dei dati.MassHunter LC/MS Quantitative Analysis versione B.07.00 è stato utilizzato per l'analisi dei dati.La sintesi chimica del complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 è stata effettuata in diverse condizioni di pH.Il PAMAM-G4 è stato essiccato utilizzando azoto gassoso ad alta purezza.Successivamente, sono state preparate tre soluzioni madre di PAMAM-G4 con acqua deionizzata (Milli-Q) a pH 7,0 (regolato con 1 M NaOH), pH 3,0 (regolato con 1 M HCl) e pH 9,0 (regolato con 1 M NaOH) a 10mg/mL.I complessi HO-AAVPA-PAMAM-G4 sono stati sintetizzati aggiungendo HO-AAVPA (0,5 mg) a diverse concentrazioni di PAMAM-G4 (10-50 μM) preparate con 500 μL di acqua deionizzata a pH 7,0, pH 3,0 e pH 9,0.Le soluzioni sono state vortexate per 2 min e poi agitate per 24 h a 25°C.Infine, i campioni sono stati centrifugati a 5000 rpm per 10 minuti utilizzando il supernatante per misurare le concentrazioni di HO-AAVPA mediante HPLC.Il complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 è stato essiccato sotto vuoto per effettuare la sua caratterizzazione chimica:Campioni di complessi HO-AAVPA, PAMAM e HO-AAVPA-PAMAM-G4 sono stati utilizzati per confrontare le concentrazioni di HO-AAVPA prima e dopo la sintesi dei complessi HO-AAVPA-PAMAM-G4.Le condizioni cromatografiche hanno utilizzato una colonna Zorbax SB-C18 in fase inversa a 35 °C.La portata era di 1,0 mL/min, iniettando 10 µL.Il gradiente consisteva nella fase mobile A (Acetonitrile) e nella fase mobile B (Acqua) per 13 min.Il gradiente è iniziato al 60% A, aumentando fino all'80% A in 6 min, quindi mantenuto fino a 8 min.Le condizioni iniziali sono state restituite entro 10 minuti ed è stato incluso un tempo di riequilibrio di 3 minuti. La fase mobile includeva l'eluizione isocratica di una miscela di acqua al 60% e acetonitrile al 40%.La massima lunghezza d'onda di assorbanza era di 242 nm.Il metodo analitico utilizzato per la quantificazione dell'HO-AAVPA è stato sviluppato e validato.Complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 (cm−1): 3540 (O–H), 2985,5 e 2946,2 (C–H);1741,5 (Do=O);1474, 1448, 1047,3 (N–C);1373,9 (C–O–H) e 1241,1 (C–O).Complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4: 1H NMR (750 MHz, D2O): δ 8,10 (s, 1H, NH), 7,5–6,5 (m, dovuto a HO-AAVPA-Ar-H), 3,29 (s, 1H , H-3), 3,22 (s, 1H, H-4), 3,12 (s, 1H, H-5), 2,81 (s, 1H, H-1), 2,62 (s, 1H, H-6), 2,40 (s, 1H, H-2), 1,5–1,2 (m, a causa di HO-AAVPA-CH2-), 0,7 (s, a causa di HO-AAVPA-CH3-).13C NMR ppm (187,5 MHz, D2O) δC: 175,0 (C), 174,5 (C), 174,4 (C), 174,3 (C), 51,2 (CH2), 49,0 (CH2), 41,1 (CH2), 41,0 (CH2) , 40,9 (CH2), 40,3 (CH2), 39,9 (CH2), 39,7 (CH2), 38,6 (CH2), 36,7 (CH2), 32,7 (CH2).La massa esatta del complesso HO-AAVPA, PAMAM-G4 e HO-AAVPA-PAMAM-G4 determinata da LC-ESI-QTOF-MS/MS era: HO-AAVPA = 235,1645 g/mol, PAMAM-G4 = 14.214,3425 g/mol , complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 = 16.398,1767, 16.882,4909 e 16.948,9560, il che significa che 9, 11 e 12 molecole HO-AAVPA sono state accoppiate su PAMAM-G4, rispettivamente.Per esplorare la stabilità chimica di HO-AAVPA e del complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4, questi sistemi sono stati sottoposti a studi di degradazione forzata in diverse condizioni di stress: acido, base, ossidazione, calore e luce solare.Sono state preparate soluzioni madre del complesso HO-AAVPA e HO-AAVPA-PAMAM-G4 (2 mg/mL).Dalla soluzione madre, 2 mL sono stati collocati in flaconi da 10 mL da trattare nelle seguenti condizioni:Condizioni acido-basiche Per la condizione acida, 1 mL di 0,1 M HCl è stato aggiunto alla soluzione madre.Per la condizione di base, 1 mL di NaOH 0,1 M è stato aggiunto alla soluzione madre da mantenere per 24 ore.Quindi, le reazioni sono state neutralizzate utilizzando 1 mL di 0,1 M NaOH per condizioni acide e 1 mL di 0,1 M HCl per condizioni basiche.Infine, ciascun campione è stato miscelato con la fase mobile (ACN: Water 60:40) diluita a 0,4 mg/mL.Ossidativo 1 mL di 3,0% H2O2 è stato aggiunto alla soluzione madre da mantenere per 8 h ed è stato poi portato a volume con la fase mobile.Calore La soluzione madre è stata miscelata con la fase mobile in una bottiglia chiusa che è stata sottoposta a 50°C per 6 ore in un forno di riscaldamento.Luce solare La soluzione madre è stata miscelata con fase mobile ed esposta alla luce solare per 24 ore.I test di solubilità in acqua dell'HO-AAVPA (0, 5 mg) sono stati eseguiti utilizzando concentrazioni aumentate di PAMAM-G4 (10-50 μM).Per misurare l'HO-AAVPA libero (solubilità intrinseca), 0,5 mg di HO-AAVPA sono stati sciolti in 500 μL di acqua deionizzata a pH 7,0, pH 3,0 e pH 9,0.Per quantificare la concentrazione dei complessi HO-AAVPA-PAMAM-G4, sono state preparate curve di calibrazione da 4,0 a 1200 μg/mL utilizzando una soluzione madre di 2 mg/mL di HO-AAVPA in etanolo.Le curve di calibrazione sono state preparate per ogni condizione di pH citata.La concentrazione di HO-AAVPA presente nel complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 ad ogni pH (acido, basico e neutro) è stata determinata dall'equazione della retta ottenuta dalla corrispondente curva di calibrazione.La solubilità in acqua di HO-AAVPA a diverse concentrazioni di PAMAM-G4 è stata valutata mediante HPLC seguendo le procedure riportate altrove26,27.2 mg di HO-AAVPA sono stati collocati in diverse concentrazioni di PAMAM-G4 (da 0,0 a 10 mg/mL) in provette Eppendorf e regolati con 500 μL di acqua a pH 7,0.Per determinare la saturazione PAMAM con HO-AAVPA, i campioni sono stati agitati per 24 ore al buio a 25 °C.Quindi, le provette Eppendorf sono state centrifugate a 5000 rpm per 5 min.I profili di solubilità in acqua sono stati ottenuti tracciando la concentrazione di HO-AAVPA rispetto a diverse concentrazioni di PAMAM-G4.La costante di stabilità è stata determinata dai profili di solubilità utilizzando l'equazione di Higuchi e Connors (Eq. 1) per più siti di legame26.dove St è la solubilità molare osservata del composto, Kn:1 è la costante di stabilità media dell'equilibrio per sito di legame per un complesso:1, n è il numero di molecole HO-AAVPA per ciascuna molecola PAMAM-G4 che formano l'HO-AAVPA -PAMAM-G4 complesso, quindi, così è la solubilità molare intrinseca del HO-AAVPA e Lt è la concentrazione molare totale del PAMAM-G4.La Kd è stata valutata a pH 7,0 utilizzando una soluzione madre (2 mg/mL) di HO-AAVPA.Dalle aliquote di riserva, diverse concentrazioni di HO-AAVPA sono state collocate in provette Eppendorf contenenti PAMAM-G4 a 50 μM.Il volume finale è stato regolato con acqua a pH 7,0–1 mL.Quindi, le soluzioni sono state vortexate per 2 minuti e infine agitate per 24 ore a 25°C.Questi campioni sono stati centrifugati a 5000 rpm per 10 minuti e il surnatante è stato recuperato per misurare HO-AAVPA mediante HPLC.Dal surnatante, 500 μL sono stati trasferiti in provette di filtrazione per centrifuga (filtri centrifughi Amicon® Ultra-0,5 L, Ultracel®-3 K, marca: Millipore) per l'ultracentrifugazione a 5000 giri/min a intervalli di 10 minuti fino a ottenere uno stato stazionario (determinato da il mantenimento del volume non filtrato).Infine, le fasi non filtrate sono state recuperate e poste in fiale da 2 mL e portate a un volume di 500 μL con acqua a pH 7,0;allo stesso modo sono stati filtrati ed analizzati in HPLC per il calcolo della Kd27,28.Per quantificare HO-AAVPA accoppiato su PAMAM-G4, è stata preparata una curva di calibrazione del composto (4,0–1200,0 μg/mL).La curva è stata eseguita in triplicato da una soluzione madre di 2 mg/mL e analizzata mediante HPLC.L'aggancio molecolare di HO-AAVPA su PAMAM è stato ottenuto con il programma AutoDock 4.229.PAMAM-G4 è stato valutato in tre stati di pH: acido (ammina completamente protonata, + carica), basico (ammina non protonata) e neutro (ammina primaria protonata, + carica).Il PAMAM-G4 neutro e di base sono stati ottenuti dal toolkit per la costruzione di dendrimeri (http://www.physics.iisc.ernet.in/~maiti/dbt/home.html) mentre il nostro gruppo di lavoro ha creato l'acido PAMAM-G424.Successivamente, sono stati aggiunti atomi di idrogeno polari e sono stati aggiunti i parametri di carica parziale (Kollman) e solvatazione con il programma AutoDockTools 1.5.6.Gli studi di docking sono stati condotti utilizzando una procedura di docking cieco per esplorare l'intera struttura PAMAM-G4 sotto una griglia: 126 Å3 e spaziatura della griglia: 0,375 Å3 utilizzando l'algoritmo genetico lamarckiano, con un numero massimo di valutazioni energetiche 1 × 107 e un popolazione di 100 individui randomizzati.Sono stati utilizzati studi di docking molecolare per saturare PAMAM-G4 con HO-AAVPA per identificare il numero di molecole che possono essere ospitate su PAMAM per formare un complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4.Le cellule MCF-7 (linea cellulare di cancro al seno) e 3T3-NIH (linea cellulare di fibroblasti) sono state utilizzate per i saggi antiproliferativi del complesso HO-AAVPA, PAMAM-G4 e HO-AAVPA-PAMAM-G4.Le cellule sono state coltivate in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Gibco) integrato con 10% FBS (Fetal Bovine Serum) (Biowest) e 1% Amfotericina B/Penicillina/Streptomicina (Biowest) in un ambiente umidificato a 37 °C e 5% CO2;una volta che le cellule hanno raggiunto la confluenza, sono state staccate con PBS-EDTA per MCF-7 e tripsina-EDTA [Biowest] per (3T3-NIH) e seminate in piastre da 96 pozzetti utilizzando 5000 cellule/pozzetto e incubate a 37 ° C con il 5% di CO2 per 24 ore per consentire la loro aderenza.Da una soluzione stock HO-AAVPA (0,85 mM), sono state eseguite diverse concentrazioni di 12,5, 25, 50, 100 e 200 µM (in DMEM con DMSO 1%) vicino al suo IC50 = 192 µM13 riportato.Le concentrazioni PAMAM impiegate erano in non tossiche 12,5, 25, 50, 75 e 100 µM30.Infine, la soluzione madre del complesso HO-AAVPA-PAMAM era 1,15 mM (in acqua) diluendo a 12,5, 25, 50, 100 e 200 µM in DMEM con il 14% di acqua.Tutte le soluzioni sono state filtrate attraverso un acrodisc sterile di 0,45 μM PVDF.Gli effetti antiproliferativi del complesso HO-AAVPA, PAMAM-G4 e HO-AAVPA-PAMAM-G4 sulle cellule sono stati misurati utilizzando il test MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) .Dopo 48 ore di trattamento delle cellule, il mezzo da ciascun pozzetto è stato rimosso e sostituito con 20 μL di MTT e le cellule sono state incubate per 4 ore.Quindi, il mezzo è stato rimosso e sostituito con 100 μL di DMSO.L'assorbanza dei campioni è stata misurata a 550 nm da un lettore SCIENTIFIC MULTISKAN EX di Thermo.Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato con n = 8 per ciascuna concentrazione.L'analisi statistica dei dati è stata effettuata nel programma GraphPad Prism 8.0.1.I risultati dei test di solubilità e dialisi sono stati analizzati mediante regressione lineare (n = 3).Le curve di solubilità sono state contrastate confrontando le loro pendenze con il test F.Sono necessari studi sulla stabilità dei farmaci per tutti i composti con futuri usi medici sull'uomo.Il nostro gruppo di lavoro ha progettato e sintetizzato un set di derivati del VPA selezionando un composto denominato HO-AAVPA, antiproliferativo nelle cellule del carcinoma mammario13.Tuttavia, l'HO-AAVPA esposto ai microsomi di ratto genera due metaboliti16.Inoltre, HO-AAVPA ha una bassa solubilità in acqua che influisce sui suoi parametri farmacocinetici18.Pertanto, il composto è stato miscelato con copolimeri per migliorare la sua solubilità in acqua, tuttavia, i suoi effetti antiproliferativi diminuiscono su MDA-MB-23131 e con i liposomi hanno effetti antiproliferativi sui fibroblasti32.Inoltre, HO-AAVPA non è stato sottoposto a studi di stabilità chimica richiesti per tutti i farmaci utilizzati nell'uomo19.Quindi, gli studi di sollecitazione di forza sono necessari per HO-AAVPA perché ha un gruppo ammidico e un gruppo fenolico che potrebbero subire cambiamenti chimici dalle condizioni ambientali e indurre effetti biologici33.Inoltre, l'HO-AAVPA è stato sottoposto a uno studio di degradazione da stress forzato come riportato altrove34 per scartare la formazione di sottoprodotti35.Gli studi di degradazione da stress forzato consentono di misurare la stabilità chimica di un farmaco esponendo un composto a diverse condizioni fisico-chimiche estreme, come acido, alcalino, ossidazione, calore e luce solare36.I farmaci possono essere degradati per idrolisi37, stress ossidativo38.Questi studi sulla degradazione della forza sono necessari per determinare come maneggiare i farmaci durante le fasi di sintesi così come nelle fasi di produzione per uso umano, comprese le vie di somministrazione, le presentazioni farmaceutiche, ecc.34.I saggi di degradazione chimica su HO-AAVPA sono stati seguiti utilizzando HPLC (Fig. 2) per separare i sottoprodotti generati da analizzare (peso molecolare) mediante LC-MS/MS come per ezetemibe39.Una volta che HO-AAVPA è stato sottoposto a studi di degradazione forzata (condizioni acide e alcaline, ossidazione, calore, luce solare, ossidazione), solo la luce solare genera un sottoprodotto che corrisponde al dimmer HO-AAVPA (Fig. 3).La formazione dimmer di HO-AAVPA è possibile dalla luce solare poiché genera radicali liberi40 in grado di formare sottoprodotti come dimeri41.Inoltre, è noto che HO-AAVPA è uno scavenger di radicali liberi nella coltura cellulare che potrebbe essere dovuto al suo gruppo fenolico42.Questi risultati suggeriscono che HO-AAVPA deve essere conservato in contenitori scuri per proteggerlo dalla luce solare durante la sintesi e la manipolazione per saggi sperimentali preclinici e per futuri usi umani.Poiché HO-AAVPA viene metabolizzato in vitro dai microsomi di ratto16 e la luce solare può formare dimmer (Fig. 3), HO-AAVPA è stato accoppiato a PAMAM-G4, riportato anche altrove come vettore di ioni e farmaci43,44.L'HO-AAVPA-PAMAM è stato costruito per essere sottoposto a studi di sollecitazione di degradazione della forza con l'obiettivo di valutare le proprietà di protezione del PAMAM su HO-AAVPA.I risultati mostrano che PAMAM-G4 è in grado di eseguire e proteggere HO-AAVPA poiché non sono stati identificati sottoprodotti (Fig. 2).Prima delle analisi sperimentali, il complesso HO-AAVPA-PAMAM era completamente caratterizzato chimicamente.Il FTIR mostra un picco a 3290 cm−1 dovuto alla vibrazione di stiramento del gruppo –NH– e le bande che raggiungono un massimo di 1644 e 1560 cm−1 corrispondenti alle ammidi (–CO– NH–) come riportato da Zhang et al. al.45 per PAMAM.L'FTIR per HO-AAVPA mostra picchi a: 3259 cm−1 (N–H);2966 e 2929 cm−1 (C–H);1626 cm-1 (C=O);1603 cm-1 (C=C aromatico);vibrazioni armoniche di circa (1640–2100 cm−1) e 1390,5 cm−1 (C–O–H);così come l'assorbimento a 750 cm−1, che indica la sostituzione in posizione orto dell'anello aromatico.Infine, l'FTIR per il complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 mostra picchi a: 3540 cm−1 (O–H), che indica la formazione di legami idrogeno;2985,5 e 2946,2 cm-1 (C–H);1741,5 cm-1 (C=O);e 1474 cm-1, 1448, 1047,3 cm-1 (N-C);1373,9 cm−1 (C–O–H) e 1241,1 cm−1 (C–O).Per quanto riguarda 1H NMR per il complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4, ci sono segnali originali influenzati dalla formazione del complesso corrispondente all'idrogeno dal gruppo ammidico di HO-AAVPA e quelli dagli idrogeni delle ammine terziarie di PAMAM che suggeriscono interazioni del legame idrogeno (Fig. 4).Per quanto riguarda i risultati LC-MS/MS, HO-AAVPA mostra am/z = 235,1556 (Fig. 5A), con un errore di 0,4 ppm46.Per quanto riguarda il complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 (Fig. 5B-D), le analisi di deconvoluzione hanno mostrato diverse molecole m/z 16.398,1767, 16.882.4909 e 1648.9560, il che significa che 9, 11 e 12 molecole HO-AAVPA sono state accoppiate su PAMAM-G4 , rispettivamente.Questi segnali non sono mostrati su PAMAM-G446 (Fig. 5A).La realizzazione di questo complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 doveva migliorare la solubilità in acqua di HO-AAVPA poiché ha una bassa solubilità in acqua (elevata idrofobicità) che ostacola gli studi in vitro e mostra una ridotta biodisponibilità18.Inoltre, il PAMAM-G4 potrebbe proteggere HO-AAVPA dai danni ambientali (luce solare e citocromi) e migliorare la solubilità in acqua grazie al fenomeno di ritenzione del potenziatore25,47.Esistono studi sulla solubilità in acqua favorita dei dendrimeri, che dipendono dal pH e dalla concentrazione24.Inoltre, HO-AAVPA è stato accoppiato su PAMAM-G4 sperimentalmente utilizzando condizioni di pH acido, neutro e alcalino.I risultati hanno mostrato una maggiore solubilità in acqua di HO-AAVPA in condizioni basiche e neutre (Fig. 6A) di 96,35–134,11 μg/mL e 108,56–146,60 μg/mL rispettivamente, mentre in mezzo acido di 91,71–99,68 μg/mL.L'analisi statistica mostra una differenza statisticamente significativa (F(2,18) = 259.9, p < 0.001) tra le pendenze delle tre condizioni, essendo la condizione base quella che solubilizza la maggior quantità di HO-AAVPA.In accordo con altri rapporti con metotrexato-PAMAM-G4 in cui PAMAM-PEGilazione massimizza il carico del farmaco consentendo di identificare più siti di legame27 La misura HO-AAVPA durante la formazione del complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 è stata raggiunta come riportato altrove48 ottenendo un metodo di convalida e una curva lineare da 4 a 1200 μg/mL (dati non mostrati).La determinazione della costante di dissociazione (Kd) è stata effettuata con due metodi.Il primo, un metodo di dialisi che utilizza l'equazione di Scatchard-Klotz49 che mostra una costante di dissociazione di 1556,17 M−1 suggerendo undici molecole HO-AAVPA per ciascuna molecola PAMAM-G4 (Fig. 6B).Questi risultati concordano con un altro studio sul 5-fluorouracile su PAMAM che ha aumentato gradualmente la cattura del farmaco a seconda di PAMAM-G450.Il secondo metodo utilizzato per determinare il Kd è stato ottenuto applicando l'equazione di Higuchi e Connors (Eq. 1), trovando una costante di stabilità di 1984.81 M−1 e una costante di equilibrio di 5.03 × 10−4 M di HO-AAVPA su PAMAM-G4 .In entrambi i casi, HO-AAVPA è stato sequestrato da PAMAM-G4.Il valore della costante di stabilità indica che l'associazione tra HO-AAVPA e PAMAM-G4 è un'interazione supramolecolare reversibile, che è un risultato rilevante per l'uso dei sistemi PAMAM-G4 in applicazioni a rilascio controllato28.I risultati indicano che la solubilità in acqua di HO-AAVPA aumenta utilizzando PAMAM-G4 come vettore (Fig. 6A).Secondo la classificazione del diagramma di solubilità di fase di Higuchi e Connors (Eq. 1), i profili di solubilità HO-AAVPA corrispondono ai diagrammi di fase di tipo AL, che supportano la formazione di complessi supramolecolari con un'unica stechiometria di tipo n:1 tra HO-AAVPA e PAMAM-G4.Gli studi teorici sull'attracco replicano la stechiometria complessa sperimentale HO-AAVPA-PAMAM-G4 in condizioni acide che indicano un rilascio rapido dovuto a cavità aperte di cariche positive interne repulsive (Fig. 6A).Inoltre, il PAMAM-G4 è stato saturato con HO-AAVPA utilizzando l'attracco.I risultati mostrano che PAMAM-G4 accetta 35 molecole HO-AAVPA in condizioni basiche, 40 in condizioni neutre e 11 in condizioni acide.I risultati dell'attracco hanno mostrato una migliore affinità di HO-AAVPA su PAMAM-G4 in condizioni basiche e neutre rispetto a condizioni acide in base alle loro energie libere (ΔG) − 5,94 kcal/mol, − 6,52 kcal/mol e − 4,59 kcal/mol, rispettivamente.In mezzo acido, c'è poca interazione tra HO-AAVPA e PAMAM-G4, sebbene sia protonato in tutte le ammine che inducono effetti di repulsione dovuti alle cariche positive che consentono di catturare HO-AAVPA, ma non c'è abbastanza ritenzione51.Questi risultati concordano con altri risultati in cui cro-molyn, methotrexate e acido fusidico su PAMAM-G4 mostrano una maggiore affinità di legame in condizioni neutre e basiche rispetto a quelle acide24.Gli studi di docking raffiguravano interazioni non legate (ioniche, legami idrogeno e idrofobiche) che impegnano l'HO-AAVPA nelle cavità PAMAM-G4 concordano con altri rapporti24 essendo principalmente legami idrogeno (Fig. 7).Una volta dimostrato che PAMAM-G4 protegge HO-AAVPA, è stato interessante esplorare i suoi effetti antiproliferativi come complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4.Innanzitutto, PAMAM è stato valutato a diverse concentrazioni inferiori a 50 μM a causa del fatto che superiori a queste concentrazioni è citotossico su MCF-730 come altri rapporti52.In questo lavoro i complessi HO-AAVPA, PAMAM-G4 e HO-AAVPA-PAMAM-G4 sono stati testati come antiproliferativi nelle linee cellulari MCF-7 e 3T3 NIH (Fig. 8).HO-AAVPA e PAMAM-G4 analizzati separatamente hanno mostrato piccole risposte antiproliferative (Fig. 8).È dovuto al fatto che HO-AAVPA non si dissolve adeguatamente in soluzioni acquose contrariamente a PAMAM.Per quanto riguarda PAMAM-G4, è stato dosato a basso 50 μM in cui non è tossico30.I risultati mostrano che l'attività antiproliferativa del complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 sulla linea cellulare MCF-7 ha mostrato un IC50 = 75,3 μΜ (Fig. 8), che è inferiore all'IC50 riportato per HO-AAVPA (192,4 μM )13.Inoltre, il complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 è più citotossico nelle linee cellulari 3T3 NIH rispetto a questi composti che sono stati testati separatamente, il che potrebbe essere dovuto alla migliore solubilità in acqua di HO-AAVPA (Fig. 8).Ciò significa che PAMAM-G4 potrebbe migliorare considerevolmente le proprietà biologiche di HO-AAVPA come riportato per altre piccole molecole53.Complesso HO-AAVPA e HO-AAVPA-PAMAM sottoposto a sollecitazione forzata.(UN).Nessuno stress di degradazione forzata, (B) H2O2, (C) condizioni acide, (D) condizioni basiche, (E) condizioni di calore (F) luce solare 24 h.Per ciascuna condizione è stato inviato un bianco reagente.Verde (fase mobile), rosso (HO-AAVPA), nero (PAMAM) e blu (complesso HO-AAVPA-PAMAM).Schema di frammentazione LC-MS/MS di HO-AAVPA, che identifica alcuni sottoprodotti generati durante l'esposizione al sole.1H NMR del complesso HO-AAVPA (superiore), PAMAM (medio) e HO-AAVPA-PAMAM (inferiore).(A) Spettro di massa di HO-AAVPA (C14H21NO2 + H)+.(A) Spettro ottenuto dalla deconvoluzione dell'isotopo risolto del PAMAM.(B – D) Spettro ottenuto per deconvoluzione dell'isotopo risolto del complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4.(A) Aumento della solubilità in acqua di HO-AAVPA con aumento della concentrazione di PAMAM-G4.Blu (basico), nero (neutro) e rosso (acido).I punti rappresentano la media ± errore standard della media (SEM).Le linee sono state confrontate con la regressione lineare e il test statistico F (F(2,18) = 259,9, p <0,001).(B) Dialisi del complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 tracciato utilizzando l'equazione di Scatchard-Klotz.La costante di dissociazione = 1556,17 M−1.Undici molecole HO-AAVPA per PAMAM-G4 sono state contate secondo l'equazione di Scatchard-Klotz.I punti rappresentano la media ± SEM per x e y.HO-AAVPA ancorato su PAMAM-G4: (A) acido, (B) neutro e (C) condizioni basiche.Le strutture 3D sono state disegnate con il programma PyMol54.Vitalità cellulare dei fibroblasti 3T3 NIH e delle cellule di cancro al seno MCF-7.Saggi antiproliferativi del complesso (A) HO-AAVPA, (C) PAMAM-G4 e (E) HO-AAVP-PAMAM-G4 su fibroblasti 3T3 NIH e (B) HO-AAVPA, (D) PAMAM-G4, (F) Complesso HO-AAVP-PAMAM-G4 su cellule di cancro al seno MCF-7.Tutti i trattamenti sono stati eseguiti per 48 ore con n = 8 duplicati*** <0,05;trattamento rispetto al controllo.Alcuni farmaci hanno scarsa solubilità in acqua, oltre ad essere instabili a determinate condizioni di pH, alcuni con proprietà antitumorali, come il nostro composto HO-AAVPA.Questo ci ha portato alla valutazione dell'interazione di HO-AAVPA con il dendrimero PAMAM-G4.Il lavoro qui presentato propone un metodo diretto per valutare la relazione quantitativa struttura-affinità in un sistema dendrimero-farmaco mediante studi in silico (teoricamente) confermati da HPLC e da MS (sperimentalmente).Come previsto, in mezzo basico e neutro, HO-AAVPA ha mostrato la massima affinità per PAMAM-G4, mentre in mezzo acido, OH-AAVPA ha mostrato l'affinità più debole.Inoltre, il complesso HO-AAVPA-PAMAM-G4 ha mantenuto i suoi effetti antiproliferativi nella linea cellulare MCF-7 e ha protetto HO-AAVPA da qualsiasi tipo di degradazione (acida, basica, termica, luminosa e ossidativa).Questi risultati consentono alle opzioni farmaceutiche di eseguire HO-AAVPA in condizioni di acqua e di proteggere i farmaci dagli ambienti biologici, inclusi il metabolismo e la somministrazione di farmaci.I dati grezzi sono su: https://doi.org/10.5281/zenodo.7535687.Perri, F. et al.Controllo epigenetico dell'espressione genica: potenziali implicazioni per il trattamento del cancro.Critico.Rev. 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